【干货分享·环状RNA】circRNA 引物设计(一)

穆德

收藏于 : 2022-01-15 08:19   被转藏 : 1       转藏到我的文章库


前言

环状 RNA

环状RNA(简称circRNA,注:以下内容皆用circRNA表示)是区别于传统线性RNA的一类新型RNA,具有闭合环状结构,大量存在于真核转录组中。目前关于circRNA的研究非常热门,然而很多人苦于对调取circRNA全长及验证circRNA的成环性表达知之甚少,因而对circRNA的研究无从下手。本文通过图文并茂的方式,向大家分享circRNA调取引物及验证成环引物的设计方法,希望能帮助各位顺利开展circRNA的研究课题。

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01
circRNA全长调取(用于构建过表达载体)


1、首先根据circRNA的ID号找到全长序列,以hsa_circ_0036388为例,打开 circBase 网站http://www.circbase.org/,输入ID后搜索,得到如下界面:


 

2、点击fasta,并将弹出网页中的 circ sequence 选项更改为“spliced”,再点击 “search”,即可下载circRNA的全长序列的fasta格式。



3、fasta文件可用记事本直接打开,得到如下结果:

 


4、针对上述序列,即可设计circRNA的全长序列调取引物,设计方法与常规基因引物设计完全一致。


注:如在circRNA全长序列外,还想同时获得上下游的延伸序列,可在步骤2参数设置时填写需要延伸的碱基数,如下图所示:


02
circRNA验证引物设计 

circRNA的验证与普通mRNA相比,还需增加一条验证——确定是否成环。因此,circRNA验证引物需设计在junction site两侧,确保PCR扩增片段包含junction site(如下图所示,上图显示环状序列,下图显示线性化序列)。

                             


1、将circRNA序列的5’端300bp序列用黄色高亮标记,3’端300bp序列用蓝色高亮标记:


2、将circRNA全长序列的3’端300bp序列移至5’端300bp序列上游,得到如下序列:



3、针对2中的600bp序列设计对应的PCR引物,设计方法同常规引物设计即可,但是两条引物需要分别位于蓝色区域和黄色区域,以确保扩增产物中包含circRNA的junction site


注1:如circRNA全长小于600bp,则可将300bp相应缩短,只要保证最终扩增产物中含有junction site,确定其成环状态即可。


注2:circRNA验证表达,提取RNA后不可使用oligo dT来进行反转,必须使用随机引物。

无汉恒,不成环


汉恒生物拥有最成熟的circRNA引物设计与circRNA-QPCR验证技术,区分成环与未成环RNA。


汉恒生物为表达circRNA独家研发的成环元件,使环状RNA连入载体后在体外高效率表达,并保证插入的目的环状RNA片段正确环化。是您研究circRNA的实验利器! 

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