环状 RNA
环状RNA（简称circRNA，注：以下内容皆用circRNA表示）是区别于传统线性RNA的一类新型RNA，具有闭合环状结构，大量存在于真核转录组中。目前关于circRNA的研究非常热门，然而很多人苦于对调取circRNA全长及验证circRNA的成环性表达知之甚少，因而对circRNA的研究无从下手。本文通过图文并茂的方式，向大家分享circRNA调取引物及验证成环引物的设计方法，希望能帮助各位顺利开展circRNA的研究课题。
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1、首先根据circRNA的ID号找到全长序列，以hsa_circ_0036388为例，打开 circBase 网站： http://www.circbase.org/，输入ID后搜索，得到如下界面：
2、点击fasta，并将弹出网页中的 circ sequence 选项更改为“spliced”，再点击 “search”，即可下载circRNA的全长序列的fasta格式。
3、fasta文件可用记事本直接打开，得到如下结果：
4、针对上述序列，即可设计circRNA的全长序列调取引物，设计方法与常规基因引物设计完全一致。
注：如在circRNA全长序列外，还想同时获得上下游的延伸序列，可在步骤2参数设置时填写需要延伸的碱基数，如下图所示：
circRNA的验证与普通mRNA相比，还需增加一条验证——确定是否成环。因此，circRNA验证引物需设计在junction site两侧，确保PCR扩增片段包含junction site（如下图所示，上图显示环状序列，下图显示线性化序列）。
1、将circRNA序列的5’端300bp序列用黄色高亮标记，3’端300bp序列用蓝色高亮标记：
2、将circRNA全长序列的3’端300bp序列移至5’端300bp序列上游，得到如下序列：
3、针对2中的600bp序列设计对应的PCR引物，设计方法同常规引物设计即可，但是两条引物需要分别位于蓝色区域和黄色区域，以确保扩增产物中包含circRNA的junction site。
注1：如circRNA全长小于600bp，则可将300bp相应缩短，只要保证最终扩增产物中含有junction site，确定其成环状态即可。
注2：circRNA验证表达，提取RNA后不可使用oligo dT来进行反转，必须使用随机引物。
无汉恒，不成环
汉恒生物拥有最成熟的circRNA引物设计与circRNA-QPCR验证技术，区分成环与未成环RNA。
汉恒生物为表达circRNA而独家研发的成环元件，使环状RNA连入载体后在体外高效率表达，并保证插入的目的环状RNA片段正确环化。是您研究circRNA的实验利器！
